研究生知识库

氨基酸是一个特殊的研究对象。氨基酸是构成生命物质的最基本单元之一，并且也是联系生物界和非生物界的重要枢纽物质。毫无疑问的，氨基酸在生物体内扮演着举足轻重的角色；同样的，氨基酸也是非生命体（沉积物、土壤、陨石、贝壳类壳体、化石以及水体）重要的有机质组分。氨基酸记载着生物过程以及非生物界过程中重要的源信息和过程信息，例如生物过程：生命进化、生态系统演替、生物体生长发育、生物体与环境相互作用、器官以及分子水平的代谢以及非生物界过程：成岩成矿过程、氮污染过程（大气污染、水污染等）、沉积过程、水环境氮循环过程，硬组织形成以及古环境推断。随着单体氨基酸稳定同位素技术，CSIA-AA（包括碳、氮、氢）的广泛应用，尤其是环境学、考古学、植物生理学、生物地球化学、地质学、古生物/古气候/古环境等领域，CSIA-AA揭示阐明了一系列的自然现象和内在的机理机制作用。然而，目前国内氨基酸同位素方面的应用少有报告，可能由于氨基酸分析方法较为复杂，费时费力，分析技术手段在国内尚未普及。本研究根据研究对象以及研究目的的不同，建立并且完善了两套完整的氨基酸氮同位素分析方法：硅烷化衍生方法和酯化/酰化衍生方法。方法建立后，对两种方法测定的精度准确度进行了验证，并初步研究了两种热门的自然现象：植物对环境胁迫响应以及Hg的生物富集效应。本研究主要工作和研究结果如下：I：完善硅烷化衍生方法并对几个重要步骤重新验证阳离子处理前后氨基酸平均回收率可达到96.5%，表明绝大部分氨基酸在处理过程中没有明显损失。尽管阳离子树脂处理后氨基酸氮同位素产生了不一致趋势的改变，但是处理前后的氨基酸氮同位素具有明显的一致性（y = 1.062 x+ 0.158， R2 = 0.991），阳离子树脂纯化氨基酸是一个较为理想的方法；在保证氨基酸氮同位素值不失真的情况下，可以很大程度上减轻样品基质效应。EA-IRMS与GC-C-IRMS 测得值具有较好的线性关系（y = 0.994 x+ 2.694， R2 = 0.982），表明两种方法测得值具有良好的一致性。对GC-C-IRMS测得同位素校正后，除谷氨酸和色氨酸外，其余氨基酸氮同位素值与EA-IRMS测得值差异不超过±1‰。氨基酸TBDMSi衍生物在高温燃烧过程中导致系统精度以及灵敏度随之降低。为了解决此类问题，通过大量的实验摸索，我们通过以下步骤保证系统正常工作：每个序列仅仅运行8-9次测样程序，在序列运行结束后对反应管进行10min的通氧氧化，再用氦气反吹1h；在正式测样前，需要试运行一针氨基酸标准，对GC-C-IRMS系统进行活化处理。通过这些处理步骤，系统活性会恢复正常，氨基酸保留时间以及信号强度恢复到正常区间内。 GC-C-IRMS分析氨基酸氮同位素所需的样品量是优化δ15N测定结果的准确度和精确度必须考虑的另一个重要参数。为得到准确可靠的δ15N值，本实验中进样量为不少于20 ngN，大致相当于200mV(m/z 28)信号强度。II：15N-NO3-标记下植物叶片游离氨基酸合成研究通过15N-NO3-标记实验发现，氨基酸氮代谢途径是决定其氮同位素值得主要因素之一。在15N-NO3-同化过程中，不同氮代谢途径的氨基酸表现出不同的富集趋势。谷氨酰胺是无机氮素转化为有机氮的起点，因此谷氨酰胺在标记过程中富集最早最快；在标记后期，谷氨酰胺酰胺基氮转何为其他氨基酸或者化合物，富集趋势有所下降。由于和GS-GOGAT循环直接相关，丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸同样表现出较快的富集趋势。其他途径的氨基酸，例如芳香族氨基酸富集趋势最慢。因此，我们认为结合已知的氨基酸代谢途径以及准确可信的氨基酸氮同位素值，可以较好地理解外界因素（例如氮输入等）对植物代谢的影响。III：植物组织游离氨基酸及硝酸根氮同位素对逆境胁迫响应 研究结果表明，胁迫处理显著地改变了根系和叶片的氮代谢。首先胁迫处理显著降低叶片NO3-以及叶片总氮含量；根系NO3-含量显著下降而总氮含量明显升高；胁迫处理富集叶片δ15N-Bulk，而根系δ15N-Bulk明显贫化；根系和叶片δ15N-NO3-均表现出富集趋势。这种不同的响应趋势表明叶片和根系以不同的氮代谢方式来应对环境胁迫。胁迫处理同样造成了氨基酸浓度模式以及氮同位素特征的不同分布，尤其是对于某些特殊种类的氨基酸。一般来说，胁迫处理会使得大部分氨基酸含量升高，总游离氨基酸含量升高；氨基酸氮同位素变化没有较好的规律性。由于特定氨基酸的生理功能的差异，这些氨基酸对逆境胁迫的响应也有明显的不同。例如，谷氨酸合成途径生成的Pro会使得其δ15N值偏正，而精氨酸/鸟氨酸途径合成的Pro其δ15N值偏负；由于苯丙氨酸在植物组织中苯丙酮酸途径的重要性或者其明显的抵御逆境胁迫的生理作用，逆境条件下其δ15N往往偏正；逆境胁迫引起的植物生长缓慢会导致氨的积累，Arg和Gln的从头合成可以消除由此引起的氨毒性，Arg和Gln的氮同位素值往往是由氮源决定的，在逆境条件下表现为来自NO3-还原作用的铵根以及光呼吸或者蛋白质水解产生的铵根共同作用；Ser对不同胁迫响应最为明显，干旱胁迫使得其含量降低而盐害胁迫使得其含量上调，结合其同位素值，Ser上调可能是来自磷酸化途径。因为单一的游离氨基酸浓度或者氮同位素不可能提供足够的信息来区分植物所面临的逆境胁迫，在本研究，我们采用PCA和DFA多元分析手段对氨基酸信息需要进一步整合。分析表明，氨基酸信息可以将植物不同组织以及不同的胁迫类型较好的区分开来。在多元分析中，Pro、Ser和Gln起到很强的作用。我们还提出了两个不同的指标旨在于以数字化方式区分植物所面临的不同胁迫类型或者胁迫程度：SI以及 ΣV。胁迫处理使得这两个指标有规律的变化，SI以及ΣV在衡量植物所面临的逆境胁迫时，能表现出良好的效果。IV：氨基酸氮稳定同位素初步评估水生生物体营养级 本研究建立一套完整的蛋白质氨基酸氮同位素测定手段，氨基酸通过先酯化后酰化方法进行衍生。氨基酸衍生物在色谱中的行为有较大的区别，主要表现在出峰时间上。因此，我们首先通过MS确定了氨基酸的结构式以及在色谱柱上的保留时间。MS结果表明，大部分氨基酸在目前的衍生条件下可以转化为对应的衍生物，并且在DB-5ms色谱柱上可以良好的基线分离。与MTBSTFA硅烷化相比，NPIP衍生方法引入的C原子较少同时也没有引入Si之类的杂原子，本方法在GC-C-IRMS系统中有着出色的表现。尽管如此，对样品的前处理，一致的衍生条件以及稳定正常的GC-C-IRMS系统性能仍然是保证氨基酸氮同位素测定准确可靠的基础。基于已有的样品处理基础，本研究同样采用阳离子树脂纯化富集氨基酸；GC-C-IRMS测定氨基酸氮同位素没有造成明显的同位素分馏，并且该方法得到的δ15N值和EA-IRMS具有同等的准确度；每隔20-25个样品，GC-IsoLink燃烧炉都有必要进行重新氧化，通过氧化、活化，氨基酸保留时间和氮信号强度会恢复正常。V：氨基酸角度探讨Hg富集效应所有水生生物营养级均小于4，其中初级生产者（水绵，黑藻）位于1附近，初级消费者位于2附近，杂食性鱼类和昆虫在2.3~2.7之间，肉食性鱼类位于2.9~3.2之间。这与预期营养级位置非常接近。THg和MeHg均表现出明显的富集效应，经对数变换后，Log THg=0.93 TL + 0.11, R2=0.82; Log MeHg=1.03TL - 0.15, R2=0.86; 表明MeHg比THg富集效应更加明显。THg和MeHg沿每一级食物链传递效率(富集因子，TMF)大约为10倍左右。实际上，TMF代表着污染物在食物链中捕食关系加权平均的富集系数。由于MeHg主要通过与半胱氨酸络合进而积累在生物体蛋白质中，研究发现MeHg与半胱氨酸含量同样表现出了正相关关系，R2=0.57。表明，半胱氨酸含量可以用来初步预测生物体Hg/MeHg含量。综上所述，结合已知的Hg/MeHg的富集机制，从氨基酸角度能够更加明确Hg/MeHg生物富集效应。